化學發(fā)光免疫分析方法 (chemiluminescence immunoassay ，CLlA) 創(chuàng)建于1977 年，由 Halmann 等人在ＲIA和EIA理論的基本上，將免疫反應(yīng)的高特異性與化學發(fā)光的高靈敏性結(jié)合起來，建立的一種用于檢測微量抗原、抗體、激素、酶等的新型免疫學分析方法。今天我們從專業(yè)的角度就化學發(fā)光的方方面面進行分享。
60年代，使用的是放射免疫檢測，優(yōu)點：成本低、靈敏度高，但缺點很明顯，存在放射性污染、有效期短、操作復雜。70年代，出現(xiàn)膠體金技術(shù)，雖然操作簡單快速，然而，靈敏度低這一問題，始終無法解決，這也是技術(shù)本身決定的80年代，出現(xiàn)了酶聯(lián)免疫法和時間分辨法，比如以上海科華為代表的。國產(chǎn)企業(yè)研發(fā)的，酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測產(chǎn)品，成本低且性質(zhì)穩(wěn)定，這也是為什么到目前為止，該方法學一直沿用至今，而其靈敏度和精確度問題，也決定了他從此不能擔當大任。而時間分辨法雖然一定程度上解決了靈敏度問題，而更多的缺點也暴露出來了，操作復雜，成本高，反應(yīng)時間長，然而在化學發(fā)光還沒有問世之前，比如以上海新波為代表的，時間分辨方法學為主的國產(chǎn)企業(yè)慢慢發(fā)展了起來。如今上海新波也早就被PE完成了戰(zhàn)略收購。90年代，化學發(fā)光開始問世，雖然在國內(nèi)的推廣經(jīng)歷了很長的過程，隨著21世紀的到來，在國外技術(shù)的影響下，化學發(fā)光開始不斷發(fā)展，尤其是2010年以后，化學發(fā)光逐步開始了大面積的，時間分辨方法學替換進程，如今在免疫檢測市場，無疑化學發(fā)光是獨樹一幟，引領(lǐng)免疫檢測市場，成為免疫診斷主流技術(shù)。關(guān)于化學發(fā)光檢測原理，化學發(fā)光標記免疫分析又稱化學發(fā)光免疫分析,是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析儀器。化學發(fā)光免疫分析儀包含兩個部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)。化學發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發(fā)態(tài)的中間體，當這種激發(fā)態(tài)中間體，回到穩(wěn)定的基態(tài)時，同時發(fā)射出光子,我們可以聯(lián)想一下螢火蟲，一閃一閃的，就是生物化學反應(yīng)后發(fā)出的的光信號，而化學發(fā)光的原理也是類似的，無非是原理不同，但道理是一樣的當光子發(fā)出后，化學發(fā)光免疫分析儀器中核心探測器件也就是光電倍增管，由單光子檢測并傳輸至放大器，并加高壓電流放大，放大器將模擬電流轉(zhuǎn)化為數(shù)字電流，數(shù)字電流將發(fā)光信號由R232數(shù)據(jù)線傳輸給電腦并加以計算，得出臨床結(jié)果。而免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)直接標記在抗原（化學發(fā)光免疫分析） 或抗體（免疫化學發(fā)光分析）上或酶作用于發(fā)光底物。而關(guān)于免疫反應(yīng)體系這里必須講清楚，抗原抗體反應(yīng)，這個里面是有未知和已知的關(guān)系，如果待測物是測抗原，則抗體是已經(jīng)知道的，如果待測物是測抗體那抗原是已知的。而前面已經(jīng)講了化學發(fā)光現(xiàn)象，簡單的講就是光信號的強度和待測物濃度是成一定正比關(guān)系的，或者是可以通過，相關(guān)關(guān)系式換算出來的。技術(shù)分類是根據(jù)發(fā)光體系也就是發(fā)光劑的不同進行分類，可分為：間接化學發(fā)光、電化學發(fā)光、直接化學發(fā)光、光激化學發(fā)光。今天我們主要講講前三類目前主流的發(fā)光技術(shù)。·他是用參與催化某一化學發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP)或堿性磷酸酶（ALP)來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應(yīng)的抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，經(jīng)洗滌后，加入底物（也就是發(fā)光劑）,酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉鼈儌魉椭劣嬎銠C數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。優(yōu)勢：發(fā)光過程中作為標記物的酶基本不被消耗，發(fā)光信號強而穩(wěn)定，且發(fā)光時間較長；檢測方式簡單、成本較低。關(guān)于間接化學發(fā)光，我們要明白以下三點：1、是用酶進行標記抗原或抗體；2、標記復合物反應(yīng)過程中加入底物也就是發(fā)光劑后，經(jīng)催化和分解產(chǎn)生發(fā)光；3、光信號轉(zhuǎn)化為電信號，并由計算機進行處理和換算得到實驗結(jié)果。代表廠家：貝克曼、邁瑞、西門子、安圖等。它是用吖碇酯等直接標記抗體（或抗原）,與待測標本中相應(yīng)的抗原（或抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖碇酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑過氧化氫和氫氧化鈉形成堿性環(huán)境，吖碇酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。優(yōu)勢：試劑穩(wěn)定性好，易于保存；標記物為小分子，對標記的抗原/抗體的空間位點幾乎不造成影響；本底低，靈敏度好，結(jié)果穩(wěn)定。代表廠家：雅培、新產(chǎn)業(yè)、索靈等。關(guān)于直接化學發(fā)光，我們需要明白以下三點：1、用吖啶酯等標記物標記抗原或抗體；2標記復合物反應(yīng)過程中加入氧化劑過氧化氫和氫氧化鈉形成堿性環(huán)境進行分解和發(fā)光。；3、光信號轉(zhuǎn)化為電信號，并由計算機進行處理和換算得到實驗結(jié)果。是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)砒錠釕標記抗體(或抗原),以三丙胺(TPA)為電子供體,在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應(yīng),它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。優(yōu)勢:標記物穩(wěn)定,靈敏度高,可實現(xiàn)多元檢測,可控的反應(yīng)體系快速檢測高精密度和高靈敏度寬廣的檢測范圍。由于電化學發(fā)光免疫分析具有優(yōu)越性,是一種很有發(fā)展前途的免疫分析法,日益受到人們的重視。
關(guān)于電化學發(fā)光，我們需要明白以下三點：1、用電化學發(fā)光劑標記抗原或抗體；2、電化學反應(yīng)過程中因電子產(chǎn)生轉(zhuǎn)移而出現(xiàn)化學發(fā)光；3、光信號轉(zhuǎn)化為電信號，并由計算機進行處理和換算得到實驗結(jié)果。
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